Diagnoza COVID v samo 20 minutah z uporabo dveh encimov CRISPR

Find-IT Test

Odzivi, vključeni v test FIND-IT za odkrivanje okužbe z virusom SARS-CoV-2. Ko se encim Cas13 (levo) veže na svojo ciljno RNA, razcepi molekulo (oranžno in sivo), pri čemer sprosti aktivator (oranžen), ki polni nukleazo Csm6 (spodnji center) in sprošča fluorescenčne označevalce. Odstrani to svetlobo (zeleno) . in kažejo prisotnost virusne RNA. Zasluge: Margaret L. Umetniško delo je prispeval Liu, Medicinska fakulteta Pritzker Univerze v Chicagu

za ponavljajoča se hitra testiranja COVID-19 Pomembno je nadzorovati širjenje izbruhov, zlasti ko se pojavljajo nove, bolj prenosljive oblike.

Medtem ko je današnji zlati standard za diagnostični test COVID-19, ki uporablja qRT-PCR-kvantitativno verižno reakcijo reverzne transkriptaze-polimeraze (PCR), zelo občutljiv. kraljeva vojska Na mikroliter to zahteva specializirano opremo, več ur delovanja in centraliziran laboratorij. Posledično test običajno traja vsaj en do dva dni.

Raziskovalna skupina, ki so jo vodili znanstveniki v laboratorijih Jennifer Doudna, David Savage in Patrick Hsu Kalifornijska univerza, Berkeley, namerava razviti diagnostični test, ki je veliko hitrejši in lažji od qRT-PCR. Zdaj je združil dve različni vrsti encimov CRISPR, da bi ustvaril test, ki lahko zazna manjše količine virusne RNA v manj kot eni uri. Doudna je leta 2020 podelil Nobelovo nagrado za kemijo za izum urejanja genoma CRISPR-Cas9.

Čeprav nova tehnologija še ni v fazi, ko bi lahko konkurirala občutljivosti qRT -PCR, ki lahko zazna nekaj kopij virusa na mikroliter tekočine, lahko že pobere ravni virusne RNA – približno 30 kopij na mikroliter – dovolj za pregled prebivalstva in omejevanje širjenja okužbe.

Soavtor David Savage, profesor molekularne in celične biologije, je dejal: “Če je test primeren in dovolj hiter, v bistvu ne potrebujete občutljivosti PCR, da bi ujeli in diagnosticirali COVID-19 v skupnosti.” “Naše upanje je bilo, da bi biokemijo čim bolj pripeljali do točke, ko si lahko predstavljate zelo priročen format v okolju, kjer se lahko vsak dan testirate ob vstopu v službo.”

Raziskovalci so svoje rezultate objavili 5. avgusta 2021 v reviji Nature Chemical Biology.

Tina Liu in Jennifer Doudan

Tina Liu in Jennifer Doudna pred stavbo IGI na dan, ko je Doudna leta 2020 prejela Nobelovo nagrado za kemijo. kredit: UC Berkeley Fotografija Brittany Hosey-Small

Uprava za prehrano in zdravila je odobrila več testov, ki temeljijo na CRISPR, za nujno uporabo, vendar vsi zahtevajo začetni korak, v katerem se virusna RNA ojača, da proizvede signal za odkrivanje-ki vključuje sproščanje fluorescentne molekule. svetloba – dovolj svetla za ogled. Čeprav ta začetna ojačitev poveča občutljivost testa na isto raven kot qRT-PCR, uvaja tudi korake, zaradi katerih je test težje opraviti zunaj laboratorija.

READ  Bi lahko Marsov plaz lahko povzročil podzemna sol in taljenje ledu?

Ekipa pod vodstvom UC Berkeley je poskušala doseči uporabno občutljivost in hitrost, ne da bi pri tem žrtvovala preprostost testa.

Vodja ekipe Tina Liu je dejala: “Za aplikacije na mestu oskrbe želite hiter odziv, tako da lahko ljudje hitro vedo, ali so okuženi, na primer pred letom ali obiskom svojcev.” Raziskovalni znanstvenik v Doudninem laboratoriju na Inštitutu za inovativno genomiko (IGI), centru, osredotočenem na CRISPR, ki vključuje znanstvenike iz UC Berkeley in UC San Francisco.

Poleg dodatnega koraka je še ena pomanjkljivost začetnega pomnoževanja, da so vzorci bolnikov, ker ustvarjajo milijarde kopij virusne RNA, bolj nagnjeni k navzkrižni kontaminaciji. Nova tehnologija, ki jo je razvila ekipa, to obrne in namesto tega ojača fluorescenčni signal in odpravi glavni vir navzkrižne kontaminacije.

Tehnologija brez ojačanja, ki ji pravijo hitra integrirana jedrska detekcija v tandemu (FIND-IT), bi lahko omogočila hitre in poceni diagnostične teste za številne druge nalezljive bolezni.

“Medtem ko smo začeli ta projekt z izrecnim namenom zajezitve COVID-19, mislim, da bi lahko bila ta posebna tehnologija uporabna ne le za to pandemijo, saj je CRISPR na koncu mogoče programirati,” je dejal Liu. “Torej lahko encim CRISPR naložite s ciljnim zaporedjem virusu gripe ali virusu HIV ali kateri koli vrsti virusa RNA, sistem pa lahko deluje na enak način. Ta dokument resnično ugotavlja, da ta biokemija enostaven način za odkrivanje RNA in zmožnost zaznavanja te RNA v občutljivem in hitrem časovnem okviru, ki je lahko primeren za prihodnje aplikacije pri diagnostiki oskrbe.

Raziskovalci trenutno gradijo takšno diagnozo z uporabo programa FIND-IT, ki bo vključeval korake za zbiranje in obdelavo vzorcev ter izvedbo testa na kompaktni mikrofluidni napravi.

z uporabo tandemskih beljakovin Cas

Za odstranitev ciljnega ojačanja iz enačbe je ekipa uporabila encim CRISPR – Cas13 – za prvo odkrivanje virusne RNA in drugo vrsto proteina Cas, imenovano Csm6, za ojačanje fluorescenčnega signala.

READ  Kako opazovati, kako Mars oktobra vlada na nočnem nebu

Cas13 je škarja za rezanje RNA; Ko se veže na ciljno zaporedje, ki ga določa vodilna RNA, je pripravljeno razrezati široko paleto drugih molekul RNA. To rezalno aktivnost, ki jo sproži tarča, lahko uporabimo za odkrivanje dvojice specifične sekvence RNA za sproščanje fluorescentne reporterske molekule. Vendar pa lahko Cas13 sam po sebi potrebuje ure za ustvarjanje zaznavnega signala, ko so prisotne zelo majhne količine ciljne RNA.

Liujev vpogled je bil uporabiti Csm6 za povečanje učinka Cas13. Csm6 je encim CRISPR, ki zazna prisotnost kratkih obročev RNA in se aktivira za rezanje širokega spektra molekul RNA v celicah.

Za povečanje odkrivanja Cas13 sta skupaj s sodelavci zasnovala posebej oblikovano molekulo aktivatorja, ki se razreže, ko Cas13 odkrije virusno RNA. Delček te molekule se lahko veže in sproži Csm6, da odreže in sprosti svetlo fluorescenčno molekulo iz kosa RNA. Običajno se katalitična molekula hitro razgradi s Csm6, kar omejuje količino fluorescenčnega signala, ki ga lahko ustvari. Liu in njegovi sodelavci so razvili način kemične modifikacije katalizatorja, tako da je zaščiten pred razgradnjo, in polnjenja CSM6 za večkratno rezanje in sproščanje fluorescenčnih molekul, pritrjenih na RNA. To povzroči občutljivost, ki je 100 -krat boljša od prvotnega katalizatorja.

“Ko je aktiviran Cas13, ta mali aktivator počisti in odstrani segment, ki ga ščiti,” je dejal Liu. “Zdaj, ko je sproščen, lahko aktivira veliko različnih molekul tega drugega encima, Casm6. In tako cilj, ki ga prepozna Cas13, ne aktivira samo lastne sposobnosti rezanja RNA. To vodi v nastanek veliko več aktivnih encimov, ki lahko vsak še bolj razcepi fluorescenčnega poročevalca. “

Ekipa raziskovalcev je vključevala tudi optimizirano kombinacijo vodilnih RNA, ki omogoča bolj občutljivo odkrivanje virusne RNA s pomočjo Cas13. Ko so to združili s Csm6 in njegovim aktivatorjem, je ekipa lahko zaznala 31 kopij na mikroliter. SARS-CoV-2 RNA v manj kot 20 minutah.

Raziskovalci so v test FIND-IT v mikrofluidne vložke dodali tudi RNA, ekstrahirano iz vzorcev pacientov, da bi ugotovili, ali je mogoče preskus prilagoditi za izvajanje na prenosni napravi. Z majhno napravo s kamero lahko zaznajo RNA SARS-CoV-2, pridobljeno iz vzorcev bolnikov, pri občutljivosti, ki bi zajela okužbe s COVID-19 na njihovem vrhuncu.

READ  NASA in USPS: Novi poštni znamki praznujeta desetletje gledanja Sonca iz vesolja

“Ta pristop tandemske nukleaze – Cas13 plus Csm6 – združuje vse v eno reakcijo pri 37 stopinjah Celzija pri isti temperaturi Celzija, zato ne zahteva visokotemperaturnega ogrevanja ali toliko korakov, kot je potrebno za druge diagnostične tehnike, “je dejal Liu.” Mislim, da to odpira možnosti za hitrejše in enostavnejše teste, ki so primerljivi z drugimi obstoječimi tehnikami. “in potencialno v prihodnosti dosegli večjo občutljivost. “

Razvoj te metode za odkrivanje RNA brez ojačanja je bil posledica preusmeritve raziskav v okviru IGI, ko se je pandemija začela obračati k težavam pri diagnozi in zdravljenju COVID-19. Sčasoma se je v ta raziskovalni projekt vključilo pet laboratorijev na UC Berkeley in dva na UCSF, eden izmed mnogih v okviru IGI.

“Ko smo začeli s tem, smo upali, da bomo naredili nekaj, kar je doseglo pariteto s PCR, vendar ni zahtevalo ojačanja – to bi bile sanje,” je povedal Savage, glavni raziskovalec projekta. “In z vidika občutljivosti smo imeli za skok približno deset tisočkratno razliko. Zmanjšali smo jo na približno tisočkrat; znižali smo jo za približno tri reda velikosti. Torej,” skoraj že tam. Preteklo aprila, ko smo ga dejansko začeli kartirati, se je zdelo skoraj nemogoče. “

Referenca: Tina Y. Liu, Gavin J. Knott, Dylan CJ Smoke, John J. “Pospešeno odkrivanje RNA z uporabo tandemskega jedra CRISPR” avtorjev Desmaris, Sungmin Son, Abdul Bhuia, Shruti Jakhanwal, Noam Prives, Shreya Agarwal, Maria Diaz de Leon. Derby, Neil A. Switz, Maxim Armstrong, Andrew R. Harris, Emerick J. Charles, Brittany W. Thornton, Parinaz Fozuni, Jeffrey Shu, Stephanie I. Stephens, G. Igrajo: Renuka Kumar, Chunyu Zhao, Amanda Mok, Anthony T. Iavarone, Arturo M. Escajeda, Roger McIntosh, Shineui Kim, Eli J. Dugan, IGI Testing Consortium, Catherine S. Pollard, Ming X. Tan, Melanie Ott, Daniel A. Fletcher, Liana F. Lareau, Patrick D. Hsu, David F. Savage in Jennifer A. Doudna, 5. avgusta 2021, Nature Chemical Biology.
DOI: 10.1038/s41589-021-00842-2

Delo je podprla Agencija za napredne obrambne raziskovalne projekte (N66001-20-2-4033). Soavtorji prispevka so člani laboratorijev Jennifer Doudna, David Savage, Patrick Hsu, Liana Lareau in Daniel Fletcher na UC Berkeley; Gavin Knott na univerzi Monash v Avstraliji; Melanie Ott in Katherine Pollard na inštitutih Gladstone in UCSF; in Ming Tan iz Venamixa, raziskovalnega in razvojnega podjetja v Pleasantonu v Kaliforniji, ki proizvaja mikrofluidne naprave. Doudna je ustanoviteljica IGI in trenutno predsednica in predsednica upravnega odbora IGI, predsednica kanclerke Lee Ka Shing in profesorica kemije ter molekularne in celične biologije na UC Berkeley. Hsu, Lareau in Fletcher so fakultete na oddelku za bioinženiring.

Mojca Andreja

Nagnjena je k apatiji. Nevidni raziskovalec. Vseživljenjski guru slanine. Potovalni odvisnik. Organizator. "

Related Posts

Dodaj odgovor

Vaš e-naslov ne bo objavljen. * označuje zahtevana polja

Read also x